Analytik endogener Peptidhormone in der präventiven Dopingforschung: Nachweis hypothalamischer Releasing-Hormone und eines neuen mitochondrial-codierten Peptids aus Humanblut mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie

Für die von der Welt Anti-Doping Agentur (WADA) akkreditierten Doping-Kontrolllabore ist es enorm wichtig ihr analytisches Spektrum fortwährend zu erweitern und die technischen Möglichkeiten zu verbessern. Die Kreativität der Dopingszene und der Untergrundlabore sowie die Entwicklungen der Pharma-Branche bringen kontinuierlich neue Substanzen und Darreichungsformen, oft ohne klinische Zulassung, in den Umlauf bzw. auf den Schwarzmarkt. Für die Visionen der Nationalen Anti-Doping Agentur (NADA) Deutschland und der WADA - „saubere Leistung“ bzw. „play true“ - sind eine dauerhaft zeitgemäße Analytik und eine effektive präventive Dopingforschung unverzichtbar. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, Nachweisverfahren für neue dopingrelevante Peptidhormone - entsprechend der WADA Verbotsliste - zu entwickeln. Zwecks Robustheit, Sensitivität und Spezifität basieren die präsentierten Methoden allesamt auf Kopplungen von Flüssigkeitschromatographie (LC) und Massenspektrometrie (MS). Für die hypothalamischen Prohormone Wachstumshormon-Releasing-Hormon (GHRH) und Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) sowie das neuartige, mitochondrial-codierte Peptid MOTS-c (Mitochondrial Open reading frame of 12S rRNA-C) wurden drei grundsätzlich neue analytische Methoden entwickelt. Diese wurden konsequent, inklusive speziell angepasster Probenvorbereitung und Extraktionsverfahren, qualitativ bzw. quantitativ entsprechend den Regularien der WADA validiert. Zielanalyten, die in die jeweilige Methode implementiert wurden, sind neben den intakten humanen Peptiden auch synthetische Derivate, tierische Analoga und metabolische Stoffwechselprodukte. Letztere wurden parallel zur Methodenentwicklung in umfangreichen in vitro und in vivo Studien (Tierexperimente und authentische Humanproben) erforscht. Der erste Artikel beschreibt eine neuartige Immunoaffinitätsaufreinigung zur Extraktion der GHRH-Derivate Sermorelin, CJC-1293, CJC-1295 und Tesamorelin inklusive anschließender massenspektrometrischer Detektion. Die genannten Substanzen steigern nachweislich die Stimulation der Wachstumshormon (GH)-Ausschüttung und damit einhergehend die körpereigene Produktion von Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-I (IGF-I). Für die Aufreinigung der Proben wurde ein primärer Anti-GHRH Antikörper an speziellen Einwegspitzen für automatisches Pipettieren (D.A.R.T.s™) immobilisiert. Diese Art der Extraktion ist hochgradig automatisierbar und die aufgereinigten Proben können direkt mittels nano-Ultra Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPLC)-MS/MS analysiert werden. Die Nachweisgrenze der beschriebenen Methode beträgt <50 pg/mL in Plasma. Metabolismusstudien aller vier Substanzen wurden anhand von Rattenexperimenten sowie mittels einer humanen Ausscheidungsstudie (Sermorelin) durchgeführt. Die Nachweismethode der zweiten Veröffentlichung umfasste eine ebenfalls Antikörper (Anti-CRH)-vermittelte Aufreinigung der Analyten hCRH und zweier tierischer Analoga aus Serum und Plasma. Das Prohormon CRH steht am Anfang einer drei-stufigen Kaskade zur Stimulation der endogenen Cortisol-Synthese. Die hier beschriebene Methode ist der erste massenspektrometrische Nachweis (nanoUHPLC-MS/MS) für CRH aus Blut zu Dopingkontrollzwecken. Ein bereits etabliertes immunologisches Extraktionsverfahren wurde mit dem zuvor angewandten und adaptierten Antikörper-basierten Assay in einer Cross-Validierung verglichen. Die Nachweisgrenze (LLOD) beträgt 200 pg/mL in Plasma und Serum. Der Machbarkeitsnachweis wurde durch die Analyse authentischer Proben von Patienten einer diagnostischen CRH-Applikation erbracht. Das dritte Projekt beinhaltete die Entwicklung eines des MS-basierten Nachweises für das mitochondrial-codierte Peptid MOTS-c aus Plasma. Aufgrund seiner in der Literatur beschriebenen Funktion als Stoffwechsel-Modulator und Aktivator der Adenosinmonophosphat-aktivierten Kinase (AMPK) gilt es ebenfalls als potentiell leistungssteigernde Substanz entsprechend der WADA Verbotsliste. Nach einer Probenvorbereitung durch Fällung der Plasmaproteine mit Acetonitril wurden die erhaltenen Extrakte mittels HPLC-MS/MS analysiert. Zusätzlich wurden zwei tierischen Analoga, vier in vitro Metabolite und zwei Oxidationsprodukte identifiziert und in die Methode implementiert. Die Quantifizierungsgrenze für hMOTS-c wurde auf 500 pg/mL in Plasma geschätzt. Publizierte endogene Level, die mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt wurden, konnten in einer Referenzpopulation nicht bestätigt werden. Im Direktvergleich mit einem kommerziell erhältlichen ELISA konnte gezeigt werden, dass dieser wahrscheinlich nicht bzw. nicht ausschließlich das intakte humane MOTS-c Molekül detektiert. Die im Rahmen dieser Arbeit publizierten Nachweismethoden dopingrelevanter Peptidhormone sind von großem Interesse für die Routineanalytik. Die Anwendbarkeit konnte durch erfolgreiche Validierung und Analyse von authentischen Humanproben gezeigt werden. Zukünftig können diese Methoden und die neuen Zielanalyten in den Routinebetrieb implementiert werden. Zuvor sind jedoch weiterführende Studien, insbesondere für CRH und MOTS-c, zu endogenen Konzentrationen mittels Referenzpopulationen für die Diskussion von Grenzwerten in der Ergebnisinterpretation nötig.