Anwendungen der Isotopenverhältnismassenspektrometrie sowie hochauflösender Massenspektrometrie hinsichtlich anaboler Steroide in der Dopinganalytik: Metabolitenidentifizierung und Herkunftsbestimmung

Gegenstand dieser Arbeit sind verschiedene Anwendungen der Isotopenverhältnismassenspektrometrie (IRMS) von anabolen Steroiden zur Metabolitenidentifizierung und Herkunftsbestimmung in der Doping- analytik.
Im ersten Projekt wurde die Wasserstoffisotopenmassenspektrometrie zur Metabolismusaufklärung des synthetischen anabolen Steroids Trenbolon verwendet. Das Spektrum an bisher beschriebenen Metaboliten ist sehr begrenzt und die Routinemethoden der Dopinganalytik basieren auf dem Nachweis von Epitrenbolon, Trenbolon-Glucuronid und Epitrenbolon-Glucuronid. Das Ziel des ersten Projektes bestand darin, neue Metaboliten von Trenbolon zu identifizieren, welche potentiell die analytische Nachweisbarkeit verlängern. Es wurde eine Ausscheidungsstudie mit fünffach deuteriertem Trenbolon an einem männlichen Probanden durchgeführt, die gesammelten Urinproben wurden nach verschiedenen bereits publizierten Protokollen aufgearbeitet. Mit Gaschromatographie/Isotopen- verhältnismassenspektrometrie (GC-IRMS) erfolgte die Identifizierung deuterierter Verbindungen und Fraktionen mit intensiven Signalen wurden zur Metabolitencharakterisierung mittels Hochleistungs- flüssigkeitschromatographie/Hochauflösender Massenspektrometrie (HPLC-HRMS) analysiert. Insgesamt wurden 20 mit Deuterium markierte Verbindungen identifiziert, darunter Glucuronsäurekonjugate, Sulfate und mögliche Cystein-Konjugate. Für die vier vielversprechendsten Metabolite wurden zweifach dehydriertes Trenbolondiol sowie Trenbolondiketon, jeweils als Glucuronid und Sulfat ausgeschieden, vorläufig als Strukturen identifiziert. Diese Metabolite waren bis zu fünf beziehungsweise sechs Tage nachweisbar. Die Strukturaufklärung erfolgte sowohl anhand der hydrolysierten und acetylierten Derivate als auch anhand der intakten Phase-II Metabolite mit Massenspektrometrie im Parallel Reaction Monitoring und Pseudo-MS3 Modus. Die Produktionenmassenspektren wurden mit kommerziell erhältlichem und synthetisiertem Referenzmaterial verglichen.
Natürlich vorkommende, aber synthetisch hergestellte Steroide stehen im Focus der anderen beiden Projekte. Endogene und exogene Steroide können anhand der Kohlenstoffisotopie mittels Isotopen- verhältnismassenspektrometrie eindeutig unterschieden werden. Methoden auf dem Stand der Technik basieren auf bis zu zwei HPLC-Aufreinigungsschritten und sind sehr zeit- und arbeitsintensiv. Um den manuellen Aufwand und die Analysedauer zu reduzieren, wurden zwei verschiedene Techniken angewandt, welche die HPLC-Aufreinigung der etablierten Methoden umgehen.
Die Technik der Multi-Immunoaffinitätschromatographie (IAC) wurde im zweiten Projekt verwendet. Das Prinzip beruht auf einer selektiven Antigen-Antikörper-Bindung. Für diese Methode wurden drei Antikörper gegen Testosteron (T), Pregnandiol und 11-Ketoetiocholanolon zu einem Multi- Immunoaffinitätschromatographiegel kombiniert. Aufgrund von Kreuzreaktivitäten konnten zusätzlich Etiocholanolon, Androsteron, 5β-Androstandiol und 5α-Androstandiol extrahiert und somit in den Assay mit aufgenommen werden. Die Methode wurde unter Berücksichtigung der Parameter Präzision, Wiederfindung und Verschleppung validiert. Zudem wurden Lineare Mischungsmodelle durchgeführt.
Für die Bestimmung der Kohlenstoffisotopie wurde als alternative Technik die multidimensionale Gaschromatographie (MDGC) im Rahmen des dritten Projektes verwendet. Bei der MDGC werden zwei GCs mit Chromatographiesäulen unterschiedlicher Selektivität miteinander verbunden. Ausgewählte
Peaks werden druckgesteuert von der ersten auf die zweite Dimension zur Verbesserung der Peakreinheit übertragen. Zusätzlich zu den im zweiten Projekt gemessenen Analyten wurde auch 5α- Androsten-16-en-3α-ol analysiert. Die Methode wurde ebenfalls nach den Kriterien der WADA validiert und es wurden Lineare Mischungsmodelle durchgeführt. Zusätzlich wurde eine Referenzpopulation bestehend aus 74 Athletenproben untersucht. Anhand dieser Daten wurden Referenzlimits abgeleitet und diese wurden zusätzlich für einen Methodenvergleich zu der etablierten Methode genutzt. Aufgrund von Matrixeffekten und geringerer Präzision sind die Referenzlimits für Δδ13C-Werte unter Verwendung von T als Zielanalyt vergleichsweise hoch, daher kann eine exogene Steroidapplikation mit T nicht so sensitiv angezeigt werden wie mit den anderen Zielverbindungen. Eine Ausscheidungsstudie mit 4-Androstendion diente als Proof-of-concept.
Beide Methoden erzielten eine Reduktion des Zeitaufwandes im Vergleich zu der etablierten Routinemethode. Bei dem IAC Ansatz konnte zudem das benötigte Urinvolumen reduziert werden, wogegen die MDGC Methode vor allem von dem reduzierten Arbeitsaufwand profitiert. Allerdings ist das HPLC-basierte Verfahren bezüglich der Aufreinigung und der Robustheit überlegen. Der IAC Ansatz wird nur bedingt als ergänzende Methode vorgeschlagen, wobei verbesserte IAC Materialien oder alternative Trägermaterialen eine Routineanwendung ermöglichen könnte. Die MDGC Methode hingegen ist für eine Anwendung in der Routineanalytik geeignet. Dort kann sie als sogenanntes IRMS-Screening eingesetzt werden, mit der auffällige Proben der Initial Testing Procedure (Steroidprofil) gemessen werden. Die CIR-Werte werden im Anschluss mit der Confirmation Procedure verifiziert.