Bioactivity of plants secondary metabolites: Estrogenic, cytotoxic and anabolic effects on estrogen target organs of an extract of Erythrina excelsa and Ecdysterone

Heilpflanzen dienen als primäre Gesundheitsversorgung in den meisten asiatischen und afrikanischen Ländern. In westlich geprägten Ländern in denen hauptsächlich auf naturwissenschaftlichen Grundsätzen basierende Medizin praktiziert wird, werden Stoffe aus pflanzlicher Herkunft entweder direkt als Kräuterformulierungen oder als Ergänzung zu bestehenden Therapien verwendet. Daneben können Pflanzen mit aktiven Wirkstoffen auch Teil der Ernährung sein. Es besteht die allgemeine Überzeugung, dass pflanzliche Heilmittel aufgrund ihres natürlichen Ursprungs sicher sind. Daher werden sie oft im Rahmen selbsttherapeutischer Maßnahmen verwendet und sind in Deutschland auch nicht rezeptpflichtig. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Bioaktivität, Wirkungen aber auch potentiellen Nebenwirkungen derartiger pflanzlicher Heilmittel. Hierbei stehen Extrakte aus Erythrina excelsa sowie die Substanz Ecdysterone im Mittelpunkt des Interesses. Erythrina excelsa ist eine Pflanze die in der kamerunischen traditionellen Medizin zur Behandlung von Wechseljahrsbeschwerden und gynäkologische Tumoren Anwendung findet. Ob Erythrina excelsa allerdings wirklich pharmakologisch aktive Substanzen enthält, die derartige Wirkungen erzielen können, wurde bisher noch nicht untersucht. Ecdysterone (Ecdy) ist ein Inhaltsstoff von verschiedenen Pflanzen, die in der chinesischen, ayurvedischen und russischen traditionellen Medizin zur Behandlung unterschiedlichster Beschwerden verwendet werden. Für Ecdy konnte eine anabole Wirkung in vitro und in vivo gezeigt werden. Obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht aufgeklärt sind, wird es intensiv als Nahrungsergänzungsmittel zur Steigerung des Muskelaufbaus beworben und auch von Bodybuildern verwendet. Ein Missbrauch zum Doping in anderen Sportarten wird befürchtet. Die Ziele dieser Arbeit waren zum einen die Bioaktivität von Extrakten von Erythrina excelsa, die in Bezug zur traditionellen Anwendung in der Naturmedizin stehen, sowie die biologisch aktiven Inhaltsstoffe in den Extrakten näher zu charakterisieren. Zum anderen sollten die Mechanismen der anabolen Wirkung von Ecdysterone untersucht werden. Mittels Yeast Estrogen Screen (YES), uterotrophen Assay und des MTT-Assay konnte gezeigt werden, dass ein Äthanolextrakt von E. excelsa östrogene/anti-östrogene und zytotoxische Effekte aufweist. Eine dreitägige subkutane Verabreichung des Extraktes in einer Dosis von 50 mg/kg KG/Tag an ovariektomierten Wistar Ratten führte zu signifikanten östrogenen Wirkungen auf morphometrische Parameter der Gebärmutter (Feuchtgewicht und epithelialen Höhen) und auf die Expression von Östrogen-abhängigen Genen in der Gebärmutter (C3 und Clusterin) und in der Leber (CaBP9K und IGFBP-1). Bei einer Dosis von 100 mg/kg KG/Tag zeigte der Extrakt unerwartet auf die beschriebenen biologischen Endpunkte eine anti-östrogene Wirkung. Eine fünftägige Behandlung von Estrogenrezeptor (ER) -positiven MCF-7 Brustkrebszellen mit dem Extrakt führte zu einem biphasischen Profil: Bei niedrigen Konzentrationen kam es zu einem leichten Anstieg der Zellviabilität, bei höheren Konzentrationen dagegen zu einer Induktion von Zelltod. Dagegen wurde bei der Behandlung von ER negativen HT-29 Zellen Zytotoxizität bei allen getesteten Konzentrationen beobachtet. Um die Wirkstoffe des Extraktes näher zu charakterisieren, wurde eine Vakuum Flüssigchromatographie Fraktionierung durchgeführt. Biologisch aktive Fraktionen wurden mittels des YES Assays identifiziert und die biologische Wirkung dieser Fraktion auf Proliferation und Apotose von MCF-7-Brustkrebs-Zellen mittels Durchflusszytometrie, Genexpressionsanalyse und Immunhistochemie untersucht. Die Dichloromethan-Methanol (50:50 v/v) Fraktion (F4), die in Bezug auf östrogene und zytotoxische Wirkung die aktivste Fraktion war, zeigte eine nicht-monotone Konzentrations-Wirkungs-Kurve auf den Zellzyklus, die Proliferation und Apoptose von MCF-7 Brustkrebszellen. Bei niedrigen Konzentrationen und in Abwesenheit von E2, förderte F4 Östrogenrezenptor- abhängig die Proliferation von MCF-7 Zellen (Hochregulation von Cyclin D1 und Herunterregulation des Bax/Bcl-2-mRNA Verhältnisses). Interessanterweise wirkte F4 in den gleichen Konzentrationen bei Anwesenheit von E2, als Antagonist und verhinderte ein E2-induziertes Zellwachstum. Bei höheren Konzentrationen modulierte F4 den Zellzyklus zugunsten einer gesteigerten Apoptose (Erhöhung des Caspase-gespaltenen Zytokeratin 18, Hochregulation des Bax/Bcl-2 Verhältnisses und Herunterregulation von Cyclin-D1-mRNA). In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Halabalaki von der Abteilung für Pharmakognosie und Naturstoffchemie der Universität von Athen wurde eine weitere Charakterisierung des Extraktes mittels LC-HRMS und LC-HRMS/MS Analyse durchgeführt um die im Extrakt enthaltenen Isoflavonoide zu identifizieren. Diese Analyse zeigte, dass Pyran- und Prenyl-Isoflavonoidderivate die charakteristischen chemischen Stoffe des Extrakts sind was auch die beobachtete Kombination der biologischen Eigenschaften des Extraktes erklären könnte. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die anabolen Wirkmechanismen von Ecdysterone, Erythrina excelsa Extrakt und Genistein in differenzierten C2C12 Myoblasten, einem Zellkulturmodell für Skelettmuskelhypertrophie untersucht. Als untersuchter biologischer Endpunkt diente die Zunahme des Durchmessers von C2C12 Myotuben. Für die nähere Charakterisierung der involvierten molekularen Mechanismen wurden Studien mit Vergleichssubstanzen wie Androgenrezeptoragonisten (DHT), Androgenrezeptorantagonisten (Flutamid), anabol wirkende Peptidhormone (IGF-1) und verschiedene Östrogenrezeptor bindende Substanzen mit agonistischen (E2), antagonistischen sowie ER alpha und ER beta selektiven Bindungseigenschaften verwendet. Mit diesem Modell konnten die wachstumsfördernden Wirkungen von IGF1, DHT, E2, Ecdy und des Phytoestrogens Genistein auf die Skelettmuskulatur bestätigt werden. Co-Behandlung von Myotuben mit Ecdy und ZK führte zu einer Hemmung der Ecdy-induzierten Hypertrophie. Darüber hinaus führte auch eine Co-Behandlung von Myotuben mit E2 oder Ecdy und dem selektiven ER beta Antagonisten zu einer Antagonisierung der hypertrophen Wirkung von beiden Substanzen, was ein Zeichen von ERβ-abhängigem Effekt ist. Zusammenfassend zeigen die Befunde dieser Arbeit einerseits, dass der Extrakt von Erythrina excelsa biologische Effekte aufweist, die in engem Zusammenhang zu seiner traditionellen Verwendung stehen. Sie weisen auch darauf hin, dass diese Pflanze eine Quelle pharmakologisch aktiver Stoffe ist, die von potentiellem Interesse für weitere Untersuchungen sind. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass Stoffe mit ER beta Bindungseigenschaften das Skelettmuskelwachstum fördern. Diese Erkenntnis ist von Interesse für die Behandlung von atropischen Erkrankungen des Skelettmuskels wie z. B der altersbedingten Abnahme der Muskelmasse (Sarkopenie). Allerdings kann dieser Effekt auch zum Zwecke des Dopings missbraucht werden. Daher sind diese Befunde auch für die Ausgestaltung von Anti-Doping-Bestimmungen von Bedeutung.