Abstract
Die Entdeckung und die schnell voranschreitende Erforschung von CRISPR als RNAgesteuerte Endonuklease für Geneditierungszwecke haben den Bereich der Gentechnologie revolutioniert. Da es die präzise und vergleichsweise einfache Modifikation praktisch jeder gewünschten DNA-Sequenz ermöglicht, stellt CRISPR das meist verwendete Werkzeug zur Genmanipulation dar. Diese Entwicklung bietet jedoch auch ungeahnte Möglichkeiten der illegalen Leistungssteigerungen durch Gendoping. Eine Dopingpraktik, die gemäß der Verbotsliste der WADA jederzeit im Sport verboten ist. Demzufolge besteht ein dringender Bedarf an geeigneten Detektionsverfahren, welche die Identifizierung von CRISPR-induziertem Gendoping ermöglichen.
Demzufolge lag der Fokus dieser Arbeit auf der Entwicklung entsprechender analytischer Nachweisverfahren unter Einsatz der beiden zentralen CRISPR-Komponenten, Cas9 und sgRNA (basierend auf dem CRISPR-System aus Streptococcus pyogenes), die aufgrund ihres exogenen Charakters im menschlichen Organismus als potentielle Zielanalyten verwendet wurden.
Das erste erreichte Ziel umfasst die Detektion des Cas9 Proteins in Plasmaproben mit Hilfe eines Bottom-up-Ansatzes durch Immunoaffinitätsaufreinigung, tryptischen Verdau und anschließender HPLC-HRMS/MS-Analyse. Der Nachweis erfolgte über drei spezifische Peptide und mit Hilfe einer umfassenden Validierung konnte die Eignung der Methode für den beabsichtigten qualitativen Cas9-Nachweis mit einem LOD von 25 ng/mL bestätigt werden.
Im Anschluss daran wurde die Nutzung von SHERLOCK als komplementäre NachweisStrategie zur gezielten Identifizierung von sgRNA in Serum in Kombination mit vorangehender RT-RPA untersucht. Die anfängliche qualitative Methodencharakterisierung, durchgeführt mit Hilfe eines UV-Transilluminators, bestätigte die Spezifität der Methode und zeigte eine Sensitivität von 100 pM sgRNA in RNPkomplexierter Form. Die festgestellte Limitation der subjektiv-visuellen Ergebnisbeurteilung und die damit verbundene eingeschränkte Sensitivität erforderten jedoch eine Optimierung der Methode.
Dieses Ziel wurde in der darauffolgenden Studie durch den Austausch des Detektionsgerätes und Anpassungen der Methoden-Parameter erreicht, wodurch die Empfindlichkeit der Methode von 100 pM auf 1 fM sgRNA um den Faktor 105 verbessert werden konnte.
Als Proof-of-Concept wurden in allen drei Projekten Proben aus einer In-VivoVerabreichungsstudie analysiert. Diese Studien dienten der Simulation eines hypothetischen Gendoping-Szenarios mit lipidvermittelten CRISPR-RNP-Komplexen unter Verwendung eines Mausmodells. Die erreichten Nachweisfenster nach Applikation umfassten bis zu 8 Stunden für Cas9 und 24 Stunden für sgRNA, was die Anwendbarkeit der hier neu entwickelten Teststrategien auf zukünftige authentische Dopingkontrollproben unterstützt.
Infolgedessen konnten durch diese Forschungsarbeiten erstmals Methoden zur Erkennung von CRISPR-induziertem Gendoping vorgestellt werden, die maßgeblich zur Entwicklung effektiver Präventivmaßnahmen beitragen und damit die Dopinganalytik im Bereich des Gendopings entscheidend voranbringen.
Demzufolge lag der Fokus dieser Arbeit auf der Entwicklung entsprechender analytischer Nachweisverfahren unter Einsatz der beiden zentralen CRISPR-Komponenten, Cas9 und sgRNA (basierend auf dem CRISPR-System aus Streptococcus pyogenes), die aufgrund ihres exogenen Charakters im menschlichen Organismus als potentielle Zielanalyten verwendet wurden.
Das erste erreichte Ziel umfasst die Detektion des Cas9 Proteins in Plasmaproben mit Hilfe eines Bottom-up-Ansatzes durch Immunoaffinitätsaufreinigung, tryptischen Verdau und anschließender HPLC-HRMS/MS-Analyse. Der Nachweis erfolgte über drei spezifische Peptide und mit Hilfe einer umfassenden Validierung konnte die Eignung der Methode für den beabsichtigten qualitativen Cas9-Nachweis mit einem LOD von 25 ng/mL bestätigt werden.
Im Anschluss daran wurde die Nutzung von SHERLOCK als komplementäre NachweisStrategie zur gezielten Identifizierung von sgRNA in Serum in Kombination mit vorangehender RT-RPA untersucht. Die anfängliche qualitative Methodencharakterisierung, durchgeführt mit Hilfe eines UV-Transilluminators, bestätigte die Spezifität der Methode und zeigte eine Sensitivität von 100 pM sgRNA in RNPkomplexierter Form. Die festgestellte Limitation der subjektiv-visuellen Ergebnisbeurteilung und die damit verbundene eingeschränkte Sensitivität erforderten jedoch eine Optimierung der Methode.
Dieses Ziel wurde in der darauffolgenden Studie durch den Austausch des Detektionsgerätes und Anpassungen der Methoden-Parameter erreicht, wodurch die Empfindlichkeit der Methode von 100 pM auf 1 fM sgRNA um den Faktor 105 verbessert werden konnte.
Als Proof-of-Concept wurden in allen drei Projekten Proben aus einer In-VivoVerabreichungsstudie analysiert. Diese Studien dienten der Simulation eines hypothetischen Gendoping-Szenarios mit lipidvermittelten CRISPR-RNP-Komplexen unter Verwendung eines Mausmodells. Die erreichten Nachweisfenster nach Applikation umfassten bis zu 8 Stunden für Cas9 und 24 Stunden für sgRNA, was die Anwendbarkeit der hier neu entwickelten Teststrategien auf zukünftige authentische Dopingkontrollproben unterstützt.
Infolgedessen konnten durch diese Forschungsarbeiten erstmals Methoden zur Erkennung von CRISPR-induziertem Gendoping vorgestellt werden, die maßgeblich zur Entwicklung effektiver Präventivmaßnahmen beitragen und damit die Dopinganalytik im Bereich des Gendopings entscheidend voranbringen.
Originalsprache | Deutsch |
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Erscheinungsort | Köln |
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Verlag | Deutsche Sporthochschule Köln |
Seitenumfang | 91 |
Publikationsstatus | Veröffentlicht - 2024 |