Identification of selected in vitro generated phase-I metabolites of the steroidal selective androgen receptor modulator MK-0773 for doping control purposes

Andreas Lagojda, Dirk Kuehne, Oliver Krug, Andreas Thomas, Tina Wigger, Uwe Karst, Wilhelm Schänzer, Mario Thevis

Publication: Contribution to journalJournal articlesResearchpeer-review

Abstract

Research into developing anabolic agents for various therapeutic purposes has been pursued for decades. As the clinical utility of anabolic-androgenic steroids has been found to be limited because of their lack of tissue selectivity and associated off-target effects, alternative drug entities have been designed and are commonly referred to as selective androgen receptor modulators (SARMs). While most of these SARMs are of nonsteroidal structure, the drug candidate MK-0773 comprises a 4-aza-steroidal nucleus. Besides the intended therapeutic use, SARMs have been found to be illicitly distributed and misused as doping agents in sport, necessitating frequently updated doping control analytical assays. As steroidal compounds reportedly undergo considerable metabolic transformations, the phase-I metabolism of MK-0773 was simulated using human liver microsomal (HLM) preparations and electrochemical conversion. Subsequently, major metabolic products were identified and characterized employing liquid chromatography-high-resolution/high- accuracy tandem mass spectrometry with electrospray (ESI) and atmospheric pressure chemical ionization (APCI) as well as nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. MK-0773 produced numerous phase-I metabolites under the chosen in vitro incubation reactions, mostly resulting from mono- and bisoxygenation of the steroid. HLM yielded at least 10 monooxygenated species, while electrochemistry-based experiments resulted predominantly in three monohydroxylated metabolites. Elemental composition data and product ion mass spectra were generated for these analytes, ESI/APCI measurements corroborated the formation of at least two N-oxygenated metabolites, and NMR data obtained from electrochemistry-derived products supported structures suggested for three monohydroxylated compounds. Hereby, the hydroxylation of the A-ring located N- bound methyl group was found to be of particular intensity. In the absence of controlled elimination studies, the produced information enables the implementation of new target analytes into routine doping controls and expands the focus of anti-doping efforts concerning this new anabolic agent. Seit Jahrzehnten werden Studien zur Entwicklung neuer anaboler Wirkstoffe für therapeutische Zwecke durchgeführt, wobei sich insbesondere hinsichtlich limitierter Zielorgan- und Gewebeselektivität und damit einhergehender unerwünschter (Neben)wirkungen steroidale Wirkstoffe oftmals als begrenzt einsatzfähig herausgestellt haben. Daher wurden zahlreiche alternative Substanzstrukturen in Erwägung gezogen, die als selektive Androgenrezeptor Modulatoren (SARMs) subsummiert werden. Diese besitzen in der Regel ein nicht-steroidales Pharmakophor mit Ausnahme weniger Kandidaten wie z.B. MK-0773, welches einen 4-aza-steroidalen Nukleus trägt. Neben den intendierten therapeutischen Einsatzgebieten wurden SARMs in der Vergangenheit jedoch auch missbräuchlich im Sport eingesetzt, weswegen kontinuierliche Aktualisierungen der analytischen Strategien der Dopingkontroll- Laboratorien erforderlich sind. Da steroidale Substanzen im menschlichen Organismus nachweislich umfangreiche metabolische Transformationen erfahren wurde der Phase-I Metabolismus des MK-0773 mit Hilfe humaner Lebermikrosomen sowie elektrochemisch simuliert. Resultierende Hauptmetabolite wurden mittels Flüssigkeits-Chromatographie/hochauflösender Tandem-Massenspektrometrie nach Elektrospray Ionisation (ESI) und chemischer Ionisation unter Atmosphärendruck (atmospheric pressure chemical ionization, APCI) sowie kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR) identifiziert und charakterisiert. Unter den gewählten Bedingungen wurden zahlreiche Phase-I Metabolite des MK-0773 generiert, welche in erster Linie Produkte von Mono- und Bisoxygenierungen des Steroids darstellen. Humane Lebermikrosomen produzierten mehr als 10 mono-oxygenierte Spezies, während mittels Elektrochemie drei monohydroxylierte Metabolite erhalten wurden. Für alle Analyten wurden Elementarzusammensetzungen bestimmt und Produkt-Ionenspektren aufgenommen, durch vergleichenden ESI/APCI-Messungen wurde das Vorhandensein von mindestens zwei N-oxygenierten Metaboliten untermauert, und NMR Daten der Elektrochemie-generierten Produkte verifizierten die vorgeschlagenen Strukturen für drei Metabolite. Hier stellte der Metabolit mit Hydroxylierung der im A-Ring befindlichen und N-gebundenen Methylgruppe die Hauptkomponente dar. Sofern keine kontrollierten Eliminationsstudien mit MK-0773 vorliegen können die hier identifizierten Metabolite ersatzweise als Zielanalyten für Routinedopingkontrollen genutzt werden, um gegebenenfalls den Missbrauch dieses neuen anabolen Wirkstoffs im Sport nachweisen zu können.

Original languageEnglish
JournalEuropean journal of mass spectrometry (Chichester, England)
Volume22
Issue number2
Pages (from-to)49-59
Number of pages11
ISSN1469-0667
DOIs
Publication statusPublished - 2016

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Dive into the research topics of 'Identification of selected in vitro generated phase-I metabolites of the steroidal selective androgen receptor modulator MK-0773 for doping control purposes'. Together they form a unique fingerprint.

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