Untersuchungen zum Nachweis moderner Erythropoietin Derivate und mimetischer Agenzien mittels Rezeptoraffinitätsbasierter Extraktion, Flüssigkeitschromatographie und hochauflösender Massenspektrometrie in der Dopinganalytik

Ziel dieser Arbeit war es eine generalisierte Anreicherungsmethode zu entwickeln, die sich die Eigenschaft des Erythropoietin-Rezeptors zunutze macht, ein breiteres Spektrum natürlicher wie auch künstlich biotechnologisch hergestellter Liganden zu binden und anschließend zum Zwecke der Dopinganalytik nachzuweisen. Darunter fallen endogenes Erythropoietin, jegliche rekombinante EPO Formen, aber auch moderne Formen Erythropoietin-mimetischer Agenzien für die früher eine separate Probenaufarbeitung stattfinden musste. Das erhaltene Rezeptoreluat soll weiterhin auch bisher unbekannte potentielle Liganden anreichern, die in der Lage sind eine Dimerisierung des Rezeptors zu bewirken und somit die Erythropoiese zu Dopingzwecken zu steigern. Die Isolierung und Aufreinigung von EPOR Liganden beruht innerhalb der Dopinganalytik momentan auf der Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die zwar eine sehr hohe Sensitivität und Selektivität aufweisen jedoch eben nur für bestimmte Substanzklassen eingesetzt werden können. Der Nachteil der sich daraus ergibt ist, dass eine Aufreinigung neuer Proteine und Peptide mit stark veränderter Struktur und Affinität zum EPOR über diese bereits etablierten Antikörper nicht möglich ist. Eine zeitintensive Entwicklung und Gewinnung neuer Antikörper für eben diese Substanzen ist die Folge und verzögert die Implementierung neuer Nachweismethoden innerhalb der Dopinganalytik. Ein Großteil aller bisher therapeutisch erhältlicher Agenzien zur Steigerung des Hämatokrits wirkt über den EPOR, allen voran die Klasse der rekombinanten Formen von EPO. Eine weitere Substanzklasse ist die der Erythropoietin-mimetischen Peptide, welche mit dem Wirkstoff Peginesatide zur Therapie eingesetzt werden konnte, durch Rücknahme der Marktzulassung aber nicht mehr vertrieben wird. Jedoch gibt es auf dem Sektor der EMP, die keinerlei Strukturhomogenitäten zu EPO aufweisen, mehrere Ankündigungen, dass diese Klasse in Zukunft weiterhin eine große Rolle spielen wird. Dass beide Klassen erfolgreich über die entwickelte und hier vorgestellte Aufreinigungsmethode isoliert und anschließend nachgewiesen wurden, konnte innerhalb dieser Arbeit erfolgreich demonstriert werden. Dabei wurden sowohl moderne gelelektrophoretische/immunoaffinitätsbasierte sowie massenspektrometrische Methoden zur weiteren Charakterisierung eingesetzt um einzelne Substanzklassen gezielter zu identifizieren und nachzuweisen. So konnte auch erstmalig eine chemisch und nichtenzymatisch Cystein-spezifische Spaltung zum Nachweis Erythropoietinmimetischer Peptide für die Dopinganalytik angewendet werden. Der Einbezug und Charakterisierung von ersten Modellsubstanzen nichtpeptidischer Erythropoietin-mimetischer Agenzien erweitert den Rahmen der hier vorgestellten EPOR-aktivierenden EMA, die in Zukunft Relevanz zur künstlichen Steigerung der Erythropoiese besitzen. Erste Verfahren, wie z.B. das der Direktinjektion von Urin, die sich zum Nachweis dieser Moleküle eignen, wurden im Rahmen dieser Dissertation vorgestellt und durch erste Metabolismusstudien erweitert. Ziel war es, dadurch zukünftige nichtpeptidische Erythropoietin-mimetische Agenzien und deren für den Markt zugelassene Arzneistoffe schneller zu identifizieren und analytische Methoden adaptieren zu können. Diesen Sektor weiter aufmerksam zu beobachten und zu erforschen ist ein wichtiger Punkt der präventiven Dopingforschung.
 
The aim of the thesis was to develop a generic method that utilizes the characteristic of the erythropoietin receptor to bind endogenous and recombinant forms of erythropoietin as well as modern erythropoietin mimetic agents in combination with subsequent isolation and detection strategies. Simultaneously, the resulting receptor eluate should contain potential unknown ligands of the EPOR that were administered by cheating athletes and have the ability to dimerize the EPOR and increase the erythropoiesis. The method currently used in sports drug testing to isolate and enrich EPOR agonists employs monoclonal antibodies for a sensitive and selective purification of the target proteins. However, these antibodies can only be applied on a limited group of compounds and the isolation of compounds with slightly different molecule structures is not viable. The consequences are time-consuming biotechnological manufacturing processes of respective antibodies and the delay of implementing novel detection methods to reveal drug abuses for doping purposes. Most of the medicinal hematocrit increasing compounds directly act as EPOR dimerizing agonists, in particular all forms of recombinant EPO. Nevertheless, announcements relating to the class of erythropoietin mimetic peptides, predict a revival of this class of EMA after the withdrawal of peginesatide in 2013, taking into account that this class has no structural similarity to EPO. Recombinant forms of EPO as well as representative forms of EMP were successfully isolated and determined by means of the EPOR based assay presented in this thesis. Thereby, modern gelelectrophoretic and immunoaffinity-based methods as well as LC-MS determinations were part of the study to subsequently characterize and identify suspicious compounds. Additionally, a chemical cysteine-specific cleavage was applied to bottom up analytical processes to detect erythropoietin mimetic peptides within sports drug testing. The inclusion and determination of nonpeptidic EMA with respective metabolites help to determine and identify compound related characteristics in case of permission for therapeutic indications or being misused as doping agents. Therefore, first approaches by means of direct injections of npEMA-spiked urine or metabolism studies were performed within this study. The results contribute to adapt already existing methods for small doping agents and convict dishonest athletes in case of drug abuse. To observe new upcoming erythropoiesis increasing agents and the classes of EMA is one of the main tasks within the field of preventive anti-doping research.