Vereinfachung und Erweiterung der analytischen Methoden in der Dopinganalytik mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und hochauflösender / akkurater Massenspektrometrie

Ziel dieser Arbeit war es die Möglichkeiten der hochauflösenden / akkuraten Orbitrap Massenspektrometrie für das Anwendungsgebiet der Routine-Dopinganalytik aufzuzeigen und neue Methoden zu entwickeln, die bestehende Verfahren erweitern oder sogar ersetzen können. So konnten im Rahmen dieser Arbeit erstmals LC-HRMS/MS Methoden für den eindeutigen Nachweis von Myo-Inositol Trispyrophosphat (ITPP) und Meldonium (Mildronat®) aus Humanurin entwickelt werden, für die es starke Anzeichen eines erhöhten Missbrauchs im internationalen Spitzensport gibt. Durch die Verwendung einer speziellen chromatographischen Trennung, basierend auf einer zwitterionischen HILIC Phase sowie eines hochauflösenden Hybrid Quadrupol-Orbitrap Massenspektrometers konnte die Probenvorbereitung auf ein Minimum reduziert werden. Die Methoden zeichnen sich trotzdem durch eine hohe Spezifität, Robustheit und adäquate Empfindlichkeiten aus. Durch Analyse von 8320 offiziellen Dopingkontrollproben, die zu 2,2% Meldonium-Befunden führten, konnten hiermit erstmals die bereits vorhandenen Beweise für den enormen Missbrauch der Substanz im Sport um eindeutige analytische Daten ergänzt werden.
Aufgrund allgemein steigender Anforderungen an Dopingkontrolllaboratorien, war die Entwicklung von Multikomponenten-Methoden ein weiteres wichtiges Ziel dieser Arbeit, um eine Vielzahl verschiedener Arzneistoffklassen einfach und zuverlässig aus Humanurin nachzuweisen. Bei der Entwicklung dieser Multikomponenten-Verfahren wurde der Fokus auf eine möglichst breite Anwendbarkeit gelegt, da nicht nur niedermolekulare Verbindungen mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften, sondern auch zahlreiche peptidische Analyten erfasst werden sollten. So kann mit Hilfe einer Zwei-Injektionen-Strategie etwa die Hälfte aller im Sport verbotenen Substanzen aus den Bereichen Diuretika / Maskierungsmittel, Plasmavolumenexpander, Stimulanzien, Narkotika, selektive Androgenrezeptor-Modulatoren (SARMs), selektive Östrogenrezeptor-Modulatoren (SERMs), Stabilisatoren des Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF-Stabilisatoren), Wachstumshormon Releasing Peptide (GHRPs), β2-Agonisten, Stoffwechsel-Modulatoren, anabole androgene Steroide (AAS) und weitere dopingrelevante Substanzen gleichzeitig erfasst werden. Dabei basieren die entwickelten Verfahren auf dem sogenannten „Dilute-and-Shoot“ bzw. „Dilute-and-Inject“ Prinzip, bei denen das Probengut direkt bzw. nach Verdünnung mit geeigneten Lösungsmitteln ohne zeitaufwendige Probenvorbereitung analysiert wird. Neben einem RPLC-Setup, das universell unpolare bis mittelpolare Analyten erfasst, sorgt ein zweites Setup auf der Grundlage der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) für eine adäquate Retention hochpolarer Analyten.
Die kombinierte Verwendung gerichteter und nicht-gerichteter Messmodi erlaubt neben der sicheren Detektion bekannter Substanzen, darüber hinaus auch eine retrospektive Datenanalyse der Proben. Die Möglichkeit des schnellen Polaritätswechsels zwischen den Scans ermöglicht außerdem eine optimale Ionisierung für verschiedenartige Moleküle im selben analytischen Lauf. Das hohe Auflösungsvermögen sowie die hohe Massengenauigkeit der Orbitrap Massenspektrometrie ermöglichen im Vergleich zu den klassischerweise eingesetzen Triple-Quadrupol Massenspektrometern in der Regel eine gesteigerte Empfindlichkeit und Spezifität, vor allem bei Heteroatom-tragenden Molekülen.
Als Reaktion auf die steigenden Anforderungen an Dopingkontrolllaboratorien konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass die hochauflösende Orbitrap Massenspektrometrie im Zusammenspiel mit geeigneten flüssigkeitschromatographischen Trennmethoden großes Potential besitzt, konventionell eingesetzte Verfahren weitestgehend zu ersetzen und bietet die Möglichkeit verschiedenste Screeningprozeduren für zahlreiche Wirkstoffklassen zu vereinen, neue Analyten einfacher zu implementieren und somit die Produktivität der Laboratorien deutlich zu erhöhen.


The aim of the present thesis was to investigate possibilities of high resolution / high accuracy orbitrap mass spectrometry for developing of novel assays, which could expand or even replace existing analytical procedures in the field of sports drug testing. Thus, in this work first LC-HRMS/MS approaches for the detection of myo-inositol trispyrophosphate (ITPP) and meldonium (mildronate®) in human urine that are presumed to be frequently abused in international elite sport have been developed. By the usage of a special chromatographic separation based on a zwitterionic HILIC stationary phase as well as a high resolution hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer the sample preparation was reduced to a minimum. The assays are characterized by high specificity, robustness and adequate sensitivity. Due to the analysis of 8320 official doping control urine samples the existing evidence of meldonium usage in sport could be corroborated by unequivocal analytical data, providing 2.2% meldonium findings.According to the generally increasing demands for doping control laboratories, another important objective of this work was to develop simple and reliable multi-target assays for the detection of a variety of drug classes in human urine. When designing these multi-target assays for the detection of both small molecules exhibiting different chemical properties as well as numerous peptidic analytes, the focus was set on the broadest possible applicability. By means of a two-injection-strategy about half of all prohibited substances in sport including diuretics / masking agents, plasma volume expanders, stimulants, narcotics, selective androgen receptor modulators (SARMs), selective estrogen receptor modulators (SERMs), hypoxia inducible factor stabilizers (HIF-stabilizers), growth hormone releasing peptides (GHRPs), β2-agonists, metabolic modulators, anabolic androgenic steroids (AAS) and other doping-relevant compounds have been succesfully identified. The assays were thereby designed as so-called “dilute-and-shoot“ or “dilute-and-inject” approaches, in which urine specimens are either measured directly or after proper dilution with suitable solvents without any further time-consuming sample preparation. Besides an RPLC setup gathering non-polar to moderatly polar compounds, a second setup based on hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) ensures adequate retention of highly polar analytes.The combination of targeted and non-targeted acquisition modes enables the reliable detection of known substances and, moreover, offers the opportunity to analyse data retrospectively. Furthermore, the possibility of between-scan polarity switching provides optimal electrospray ionization conditions for various molecules in the same analytical run. In general, high resolution / high accuracy orbitrap mass spectrometey provides higher sensitivity and specificity compared to routinely used triple-quadrupole mass spectrometers, especially for molecules bearing heteroatoms.As a reaction to the increasing demands for doping control laboratories this work demonstrated that hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometery in connection with appropriate liquid chromatographic techniques offers great potential to replace conventional methods used in sports drug testing. Furthermore, the aforementioned mass spectrometric technique ensures to apply combinations of various screening procedures for many classes of drugs, simplifies to implement new analytes and thus to enormously increase the productivity of doping control laboratories.